Nuôi cấy mô cây trai Nam Bộ

iv

TÓM TẮT
KHƢU HOÀNG MINH, Đại học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh. Tháng 8/2006.
“NUÔI CẤY MÔ CÂY TRAI NAM BỘ (Fagraea cochinchinensis A.Chev.)”.
Giảng viên hƣớng dẫn: PGS.TS. TRẦN VĂN MINH
Đề tài đƣợc thực hiện tại Phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học Cây Ăn Trái,
Viện Sinh Học Nhiệt Đới tại TP.HCM. Thời gian thực hiện tháng 2 đến tháng 8 năm
2006.
Mục đích: Nghiên cứu khả năng nhân giống nhanh cây Trai in vitro nhằm cung
cấp nguồn cây giống ban đầu sạch bệnh có tính đồng nhất về mặt di truyền, phục vụ
cho công tác bảo tồn nguồn gen và trồng rừng trên quy mô lớn.
Ở nƣớc ta, cây Trai Nam Bộ là loại cây gỗ quý, gỗ thuộc nhóm I. Gỗ có mùi
chua, màu vàng có vân đẹp, màu sắc óng ánh, bền, rất cứng, nặng (d = 0,85), chịu
nƣớc và chôn lâu dƣới đất, đóng đồ gỗ nội thất cao cấp, gỗ xây dựng, gỗ lót sàn nhà,
khung tàu Đây là cây gỗ quý hiếm đƣợc xếp vào các loại cây đang bị đe dọa và mức
độ đe dọa theo phân hạng của Tổ chức bảo tồn thiên nhiên thế giới (UICN, 2001) là rất
nguy cấp và phải đối mặt với nguy cơ tuyệt chủng trong tự nhiên rất cao trong một
tƣơng lai rất gần. Do đó, chúng tôi tiến hành đề tài “NUÔI CẤY MÔ CÂY TRAI
NAM BỘ (Fagraea cochinchinensis A.Chev.)” để phục vụ cho mục đích trên.
Từ kết quả thực nghiệm, chúng tôi đạt đƣợc một số kết quả sau:
Mẫu Trai thực sinh đƣợc vô trùng tốt nhất trong dung dịch Hypo – Na 25% với
thời gian 20 – 30 phút kết hợp với dung dịch HgCl
2
0,05% trong 15 phút.
Môi trƣờng WPM + BA (0,1 mg/l) thích hợp nuôi cấy phát sinh chồi cây Trai in
vitro.
Môi trƣờng WPM + BA (1 mg/l) thích hợp cho nuôi cấy tạo cụm chồi cây Trai
Môi trƣờng WPM bổ sung BA (0,5 mg/l) thích hợp cho nhân cụm chồi cây Trai
Môi trƣờng WPM thích hợp cho quá trình tái sinh cụm chồi cây Trai in vitro.
Môi trƣờng WPM + BA (0,1 mg/l) + CW (10 %) thích hợp cho quá trình vƣơn thân
cây Trai in vitro.
Cây Trai in vitro ra rễ dễ dàng trong môi trƣờng WPM + IBA (0,3 mg/l)

v


MỤC LỤC

PHẦN TRANG
TRANG TỰA
LỜI CẢM ƠN iii
TÓM TẮT iv
MỤC LỤC v
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii
DANH SÁCH CÁC HÌNH ix
DANH SÁCH CÁC BẢNG x
DANH SÁCH CÁC BẢNG x
Phần 1. MỞ ĐẦU 1
1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1
1.2 MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU 2
1.2.1 Mục đích 2
1.2.2 Yêu cầu 2
1.3 GIỚI HẠN ĐỀ TÀI 3
Phần 2.TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
2.1 ĐẶC ĐIỂM LÂM SINH HỌC CÂY TRAI NAM BỘ (Fagraea
cochinchinensis A.Chev.) 4
2.1.1 Vị trí phân loại 4
2.1.2 Phạm vi phân bố 5
2.1.3 Đặc điểm sinh học 5
2.1.4 Giá trị sử dụng và tính chất của gỗ Trai 6
2.2 ỨNG DỤNG NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT TRONG CÔNG TÁC
CHỌN GIỐNG CÂY TRỒNG 6
2.2.1 Lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật 6
2.2.2 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào 8
2.2.3 Ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật trong chọn giống cây trồng 8
2.2.4 Ƣu điểm của phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 10

vi

2.3 VI NHÂN GIỐNG CÂY THÂN GỖ 10
2.3.1 Những thành tựu của nuôi cấy mô cây thân gỗ trong và ngoài nƣớc 10
2.3.2 Vi nhân giống từ cây còn non 13
2.3.2.1 Tổng quát 13
2.3.2.2 Nuôi cấy cơ quan 13
2.3.2.3 Nuôi cấy phôi 15
2.3.3 Vi nhân giống từ cây trƣởng thành 16
2.3.3.1 Tổng quát 16
2.3.3.2 Nuôi cấy cơ quan 17
2.3.3.3 Nuôi cấy phôi 18
2.4 CÁC PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT 19
2.4.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng 19
2.4.2 Nuôi cấy mô sẹo 19
2.4.3 Nuôi cấy tế bào đơn 19
2.4.4 Nuôi cấy Protoplast – chuyển gen 20
2.4.5 Nuôi cấy hạt phấn đơn bội: 20
2.5 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH NUÔI CẤY MÔ 20
2.5.1 Mô nuôi cấy 20
2.5.2 Vô trùng trong nuôi cấy 20
2.5.3 Điều kiện nuôi cấy 23
2.5.4 Môi trƣờng nuôi cấy 25
2.5.5 Nƣớc dừa 25
2.5.6 Vai trò của chất kích thích sinh trƣởng trong nuôi cấy 26
2.5.7 Ảnh hƣởng của than hoạt tính 28
2.5.8 Ảnh hƣởng của pH và Agar 28
Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30
3.1 VẬT LIỆU 30
3.2 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM 31
3.2.1 Thí Nghiệm 1: Vô trùng mô cấy ban đầu từ cây Trai thực sinh 32
3.2.2 Thí Nghiệm 2: Khảo sát khả năng phát sinh chồi cây Trai in vitro trên các môi
trƣờng khoáng cơ bản có bổ sung BA (0,1 mg/l). 33

vii

3.2.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của nồng độ BA đến quá trình nuôi cấy tạo cụm
chồi cây Trai in vitro. 34
3.2.4 Thí Nghiệm 4: Khảo sát sự ảnh hƣởng của BA trong nhân cụm chồi cây Trai
in vitro. 34
3.2.5 Thí Nghiệm 5: Khảo sát quá trình tái sinh cụm chồi cây Trai in vitro. 35
3.2.6 Thí Nghiệm 6: Ảnh hƣởng của nƣớc dừa (Cw) trong nhân giống cây Trai in
vitro. 36
3.2.7 Thí Nghiệm 7: Nuôi cấy tạo rễ cây trai in vitro. 36
3.3 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 37
Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38
4.1 Thí Nghiệm 1: Vô trùng mô cấy ban đầu từ cây Trai thực sinh 38
4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng phát sinh chồi cây Trai in vitro trên các
môi trƣờng khoáng cơ bản có bổ sung BA (0,1 mg/l). 43
4.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của BA đến quá trình nuôi cấy tạo cụm chồi cây
Trai in vitro. 45
4.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát sự ảnh hƣởng của BA trong nhân cụm chồi cây Trai
in vitro. 47
4.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát quá trình tái sinh cụm chồi cây Trai in vitro. 49
4.6 Thí nghiệm 6: Ảnh hƣởng của nƣớc dừa (Cw) đến nhân nhanh cây Trai in
vitro. 51
4.7 Thí nghiệm 7: Nuôi cấy tạo rễ cây Trai in vitro. 54
Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 56
5.1 KẾT LUẬN 56
5.2 ĐỀ NGHỊ 56
Phần 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO 57
Phần 7. PHỤ LỤC a

viii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BA : Benzyl adenine
Ki : Kinetin
2,4-D : Dichlorophenory acetic acid
HgCl
2
: Thủy ngân chlorite
IAA : -indole acetic acid
IBA : -indole butyric acid
NAA : -naphtalen acetic acid
Cw : Nƣớc dừa (Coconut water)
Suc : Đƣờng sucrose
CRD : Completely randomized design
Ctv : Cộng tác viên
CV : Hệ số biến động
LSD : Sai số nhỏ nhất
MS : Murashige – Skoog, 1962
WPM : Lloy – Mc Cown, 1980
CRC : Critically Endangered

ix

DANH SÁCH CÁC HÌNH


Hình 2.1: Thân cây Trai trƣởng thành (A). Hoa (B), cành mang quả cây Trai (C). 29
Hình 4.1: Mẫu thực sinh cây Trai đƣợc vô trùng phát sinh chồi (A), (B) từ đốt
thân; (C), (D) từ đốt ngọn. 42
Hình 4.2: Khả năng phát sinh chồi cây Trai in vitro từ nuôi cấy chồi đỉnh trên môi
trƣờng MS (A), và WPM (B) có bổ sung BA (0,1 mg/l). 44
Hình 4.3: Ảnh hƣởng của BA đến quá trình nuôi cấy tạo cụm chồi cây Trai in
vitro. Cụm chồi trên môi trƣờng có nồng độ BA 0,1 mg/l (A); nồng độ
0,5 mg/l (B); nồng độ 1 mg/l (C). 46
Hình 4.4: Nhân cụm chồi cây Trai in vitro trên môi trƣờng có bổ sung BA. (A)
nồng độ 0,01 mg/l; (B) nồng độ 0,1 mg/l ; (C) nồng độ 0,5 mg/l. 48
Hình 4.5: Tái sinh cụm chồi cây Trai in vitro trên môi trƣờng khoáng cơ bản MS
(A), WPM (B). 50
Hình 4.6: Cây Trai in vitro vƣơn thân trên môi trƣờng có chứa nƣớc dừa (A) 5%
nƣớc dừa; (B) 10% nƣớc dừa. 53
Hình 4.7: Cây Trai in vitro ra rễ trong môi trƣờng WPM bổ sung IBA (0,3 mg/l). 55
Hình 4.8: Cây Trai in vitro ra rễ đƣợc thuần hóa và ra bầu đất trong điều kiện
vƣờn ƣơm. 55

x

DANH SÁCH CÁC BẢNG


Bảng 3.1a: Ảnh hƣởng của nồng độ Natri hypochlorite và thời gian xử lý vô trùng
mẫu 32
Bảng 3.1b: Ảnh hƣởng của nồng độ Natri hypochlorit, HgCl
2
và thời gian xử lý vô
trùng mẫu 33
Bảng 3.2: Khả năng phát sinh chồi cây Trai in vitro trên các môi trƣờng khoáng cơ
bản có bổ sung BA (0,1 mg/l) 34
Bảng 3.3: Ảnh hƣởng của nồng độ BA đến khả năng tạo cụm chồi cây Trai in vitro . 34
Bảng 3.4: Ảnh hƣởng của BA trong nhân cụm chồi cây Trai in vitro 35
Bảng 3.5: Tái sinh cụm chồi cây Trai in vitro 35
Bảng 3.6: Ảnh hƣởng của nƣớc dừa (Cw) đến nhân nhanh cây Trai in vitro 36
Bảng 3.7: Nuôi cấy tạo rễ cây Trai in vitro 37
Bảng 4.1a: Ảnh hƣởng của nồng độ Natri hypochlorit và thời gian xử lý vô trùng mẫu
40
Bảng 4.1b: Ảnh hƣởng của nồng độ Natri hypochlorit, HgCl
2
và thời gian xử lý vô
trùng mẫu. 41
Bảng 4.2: Khả năng phát sinh chồi cây Trai in vitro trên các môi trƣờng khoáng cơ
bản có bổ sung BA (0,1 mg/l). 43
Bảng 4.3: Ảnh hƣởng của BA đến quá trình nuôi cấy tạo cụm chồi cây Trai in vitro . 45
Bảng 4.4: Ảnh hƣởng của BA trong nhân cụm chồi cây Trai in vitro 47
Bảng 4.5: Tái sinh cụm chồi cây Trai in vitro 49
Bảng 4.6: Ảnh hƣởng của nƣớc dừa (Cw) đến nhân nhanh cây Trai in vitro 52
Bảng 4.7: Ảnh hƣởng của các auxin đến sự ra rễ cây Trai in vitro 54
1


Phần 1. MỞ ĐẦU

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ
Năm 1964, Xukasov đã viết: “Có thể khẳng định không có một thảm thực vật nào
có ích cho loài ngƣời nhƣ rừng ” (Lâm Xuân Sanh, 1982).
Rừng là một môi trƣờng sống của con ngƣời và các hệ sinh vật khác trên trái đất,
là mái nhà che chở, là niềm tự hào của nhiều Quốc gia. Rừng là nguồn cung cấp tài
nguyên dồi dào cho sự phát triển của nền kinh tế đất nƣớc.
Ngoài ra, rừng còn giữ vai trò vô cùng to lớn trong hệ sinh thái chung của hành
tinh, và bản thân rừng là hệ sinh thái lớn phức tạp và tự điều chỉnh (Siscop, 1987).
Hàng ngày, hàng giờ cây cối trong rừng tiến hành quá trình quang hợp đã cung cấp
một lƣợng lớn Oxy, hấp thụ khí CO
2
do ngƣời và động vật thải ra (Trần Cẩm Vân,
Bạch Phƣơng Lan, 1995).
Tuy nhiên qua nhiều thập kỷ, rừng trên thế giới đang ngày càng bị tàn phá nặng
nề do nhiều nguyên nhân, đặc biệt là do sự tàn phá quá mức ở các nƣớc đang phát triển
và sự suy kiệt của các rừng nhiệt đới. Các nhà khoa học đã đánh giá hệ sinh thái rừng
nhiệt đới là phức tạp nhất nhƣng cũng rất dễ bị suy tàn, khả năng phục hồi kém sau
những tác động nghiêm trọng.
Tại hội nghị Lâm nghiệp thế giới (1986) đã nêu: “ Rừng nhiệt đới chẳng khác gì
con ngỗng đẻ trứng vàng. Nếu một lần chỉ lấy đi một phần nhỏ thì sản xuất sẽ đƣợc
duy trì mãi mãi, nhƣng lấy đi tất cả thì nó sẽ mất vĩnh viễn.” Thực tế là con ngƣời đã
lấy đi quá nhiều từ cây gỗ lớn đến cây bụi, cây cỏ, từ các động vật lớn, nhỏ và kể cả
đất rừng cũng bị thu hẹp dần. Trong khi đó, con ngƣời chƣa khôi phục, chƣa trả lại cho
rừng đƣợc bao nhiêu.
Trong lời tựa cuốn “Công nghệ vi sinh bảo vệ môi trƣờng” Mai Đinh Yên
(1995) đã viết: “Những cánh rừng bạt ngàn xanh tƣơi – lá phổi của trái đất đang ngày
càng bị thu hẹp diện tích và có nguy cơ biến mất dần đi. Hệ sinh thái phong phú trên
trái đất – sản phẩm chọn lọc ngàn đời của thiên nhiên, vốn rất cân bằng và đa dạng
đang bị con ngƣời dần dần phá vỡ”.
2


Trong khi nƣớc ta nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, lƣợng mƣa hàng
năm cao và tập trung chủ yếu vào mùa mƣa. Những điều kiện này thích hợp cho sự
sinh trƣởng và phát triển của cây Trai Nam Bộ. Đây là cây gỗ quý hiếm đƣợc xếp vào
các loại cây đang bị đe dọa và mức độ đe dọa theo phân hạng của UICN (2001) là rất
nguy cấp và nguy cơ tuyệt chủng trong tự nhiên cao. Về giá trị kinh tế đây là cây gỗ
đang đƣợc các nhà kinh doanh và chế biến gỗ quan tâm do nó có giá trị kinh tế cao.
Ngoài việc đƣợc dùng để đóng các đồ gỗ cao cấp, làm vật liệu xây dựng, khung tàu
thuyền… thì cây Trai Nam Bộ còn đƣợc dùng để trồng rừng phủ xanh đồi trọc, trồng
trang trí ở các đƣờng phố. Ở nƣớc ta, cây Trai chƣa đƣợc trồng phổ biến, trong khi đó
nhu cầu sử dụng gỗ cây Trai nói riêng và các loại gỗ có phẩm chất tốt ngày càng tăng
cao trong xã hội.
Để đáp ứng nhu cầu trong nƣớc về cây Trai giống chất lƣợng và sạch bệnh phục
vụ công tác bảo tồn nguồn gen và trồng rừng trên quy mô lớn, chúng tôi thực hiện đề
tài “NUÔI CẤY MÔ CÂY TRAI NAM BỘ (Fagraea cochinchinensis A.Chev.)”.

1.2 MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU
1.2.1 Mục đích
 Nghiên cứu khả năng nhân giống nhanh cây Trai in vitro nhằm cung cấp
nguồn cây giống ban đầu sạch bệnh có tính đồng nhất về mặt di truyền, đáp
ứng yêu cầu cây giống phục vụ cho công tác bảo tồn nguồn gen và trồng
rừng trên quy mô lớn.
1.2.2 Yêu cầu
Vô trùng mẫu nuôi cấy
Khảo sát quá trình phát sinh chồi cây Trai in vitro trên các môi trƣờng
khoáng cơ bản có bổ sung BA (0,1 mg/l)
Ảnh hƣởng của BA đến quá trình nuôi cấy tạo cụm chồi cây Trai in vitro
Khảo sát sự ảnh hƣởng của BA trong nhân cụm chồi cây Trai in vitro
Khảo sát quá trình tái sinh cụm chồi cây Trai in vitro
Ảnh hƣởng của nƣớc dừa (Cw) trong nhân giống cây Trai in vitro
Nghiên cứu nuôi cấy tạo cây Trai in vitro hoàn chỉnh

3



1.3 GIỚI HẠN ĐỀ TÀI
Do thời gian nghiên cứu có hạn, đề tài chỉ tập trung nghiên cứu các kỹ thuật liên quan
đến việc hoàn thiện quy trình nuôi cấy in vitro cây Trai Nam Bộ (Fagraea
cochinchinensis A.Chev.).

Xem chi tiết: Nuôi cấy mô cây trai Nam Bộ